Transformation of Coffee arabica using chitinase gene and regeneration of planlets from transformed-zygotic embryos Transformasi Coffea arabica menggunakan gen kitinase dan regenerasi planlet dari embrio zigotik-transforman

Abstract

Ringkasan

Rekayasa genetika kopi arabika tahan penyakit cendawan dapat dilakukan dengan  cara memasukkan gen kitinase (gen chi) ke dalam genom tanaman tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengintroduksikan gen chi pada  kopi arabika serta meregenerasi eksplan yang ditransformasi menjadi plantlet. Gen chi disubkloning dari pBS G11 ke dalam plasmid pCAMBIA2301. Melalui Agrobacterium tumefaciens, plasmid rekombinan pCAMBIA2301/35s-chi kemudian dimasukkan ke dalam eksplan daun dan embrio zigotik kopi arabika. Eksplan daun transforman ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung kanamisin untuk induksi kalus embriogenik . Beberapa kombinasi 2,4-D dan dicamba serta kinetin, BAP dan 2-iP diuji kemampuannya untuk menginduksi terbentuknya kalus embriogenik. Embrio zigotik transforman ditumbuhkan pada media MS modifikasi yang mengandung kanamisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan tipe sitokinin dan kombinasinya dengan 2,4-D atau dicamba. menyebabkan terjadinya variasi  persentase pembentukan kalus embriogenik tahan kanamisin.  Penambahan 100 mg/L kanamisin dalam media seleksi cukup efektif untuk menghambat pertumbuhan eksplan daun nontransforman. Persentase tertinggi induksi kalus embriogenik pada eksplan daun non transforman maupun transforman diperoleh pada media yang mengandung 5 mM 2,4- D dengan 5 mM of kinetin atau 5 mg/L dicamba dengan 5 mM BAP. Sedangkan dalam media dengan penambahan 5 mM kinetin, 100 mg/L asam sitrat dan 100 ppm asam askorbat, jumlah eksplan yang membentuk kalus mencapai optimum pada konsentrasi 0 dan 1 ppm dicamba untuk eksplan transforman dan 10 mg/L dicamba untuk non transforman. Pada eksplan embrio zigotik transforman, peningkatan konsentrasi kanamisin dari 100 mg/L hingga 500 ppm menurunkan persentase pengecambahan embrio dari 80.5 % menjadi 49%, persentase perakaran, dari 34 % menjadi 16%, jumlah akar, panjang akar dan tinggi tunas dari 7 mm menjadi 4 mm.  Pada semua perlakuan kanamisin, embrio zigotik non transforman tidak membentuk akar dan pada umur kultur yang sama tunas yang dihasilkan lebih pendek dibandingkan dengan embrio-zigotik transforman. Hasil tersebut membuktikan bahwa gen ketahanan terhadap kanamisin (NPTII) telah terinsersi dan terekspresi dengan baik pada plantlet kopi arabika yang berasal dari eksplan embrio-zigotik transforman. Karena gen chi  dikonstruksi dalam satu vektor dengan NPTII, maka diharapkan gen tersebut juga telah terinsersi ke dalam genom tanaman kopi.

Summary

Genetic engineering of arabica coffee resistant to fungal diseases might be done by introducing a chitinase-encoding gene (chi) into genome of this plant. This research was aimed to introduce chi construct into arabica coffee and regenerate plantlets from the transformed explants. The chi gene was previously subcloned from pBS G11 into pCAMBIA2301 plasmid. With Agrobacterium tumefaciens,the recombinant plasmid pCAMBIA2301/35s-chi was then introduced into leaf and zygotic embryos explants of arabica coffee. The transformed leaf explants were cultured on the selection media containing kanamycin in the presence of several combinations of 2,4-D and dicamba with kinetin, BAP and 2-iP to induce the formation of embryogenic callus. The transformed zygotic embryos were cultured on the media of modified MS containing  kanamycin. The results showed that the several types of cytokinin used in combination with 2,4-D or dicamba caused the percentage of kanamycin resistant-embryogenic calli was varied. The addition of 100 mg/L kanamycin in the selection media was effective for inhibiting the  growth of untransformed explants. Among the several combinations of auxin and cytokinin tested, the highest percentage of embryogenisis for untransformed and transformed leaf explants  were achieved on the media containing 5 mM 2,4-D and 5 mM kinetin or 5 mg/L dicamba and 5 mM BAP. However in the presence of 5 mM kinetin together with antioxidants of 100 mg/L citric acid and 100 mg/L ascorbic acid, the explants calluses was optimum at 0 - 1 mg/L dicamba for transformed explants and 10 mg/L dicamba for untransformed explants. In the explants of transformed-zygotic embryos, increasing kanamycin from 100 mg/L up to 500 mg/L decreases the percentage of embryo germination from 80.5 % to 49%, rooted-shoots from 34 % to 16%, number of roots, root length and shoot length from 7 mm to 4 mm.  At all the kanamycin treatments, root was not developed from the untransformed-zygotic embryos and the lenght of shoots were shorter compared to the transformed-zygotic embryos. This result demonstrates that the kanamycin-resistant gene (NPTII) has been inserted and well expressed in the plantlets of arabica coffee derived from transformed-zygotic embryos. Since the chi gene was constructed in one vector with NPTII, this gene might also been inserted in the genome of coffee.