Evaluation of eleven reference genes for Reverse Transcriptase Quantitative PCR of rubber tree under water deficit Evaluasi sebelas gen referensi untuk Reverse Transcriptase Quantitative PCR pada tanaman karet tercekam kekeringan

Abstract

Abstrak

Reverse Transcriptase Quantitative PCR (RT-qPCR) merupakan teknik yang sangat ampuh untuk mendeteksi jumlah mRNA yang rendah dalam sel tanaman. Pengukuran akumulasi transkrip tersebut relatif terhadap kontrol ekspresi seperti gen-gen housekeeping. Keandalan teknik RT-qPCR ber-gantung pada pemilihan kontrol internal yang disebut pula gen referensi. Hal tersebut menjadi alasan kenapa validasi gen referensi disarankan untuk setiap set sampel cDNAs yang akan diguna-kan pada eksperimen RT-qPCR baru. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis stabilitas sebelas gen-gen housekeeping terpilih pada tiga organ Hevea brasiliensis (daun, kulit batang dan akar) tercekam kekeringan moderat selama 15 hari. RNA total diisolasi dari 18 sampel yang terdiri dari tanaman kontrol dan tercekam kekeringan pada hari ke-0 (D0), ke-5 (D5) dan ke-15 (D15). Kualitas cDNA yang disintesis divalidasi dengan amplifikasi PCR menggunakan primer HbActin. Kesebelas pasangan primer penyandi gen-gen housekeeping pada Hevea (HbActin, HbelF1Aa, HbUBC4, HbUBC2b, HbYLS8, HbRH2b, HbRH8, HbUBC2a, HbαTub, Hb40S dan HbUBI) divalidasi dengan amplifikasi PCR. Nilai Crossing-point (Cp) yang diukur dengan metode derivatif kedua pasca analisis RT-qPCR mengungkapkan nilai rerata Cp yang lebih tinggi secara signifikan untuk kesebelas gen housekeeping pada titik sampling D5 dibanding D0 dan D15. Studi ini menyarankan bahwa metode perhitungan koefisien keragaman (CV) sederhana dapat digunakan untuk menentu-kan peringkat gen referensi pada tanaman karet berdasarkan ekspresinya yang stabil. Lima gen housekeeping (HbRH2b, HbRH8, HbUBC4, HbαTUB dan HbActin) dapat digunakan sebagai gen referensi untuk analisis RT-qPCR pada Hevea brasiliensis yang tercekam kekeringan moderat. Gen HbRH2b memiliki ekspresi paling stabil dibanding yang lain.

Abstract

Reverse Transcriptase Quantitative PCR (RT-qPCR) is a powerful technique in order to detect low abundance of mRNA in the plant cell. The measurement of transcript abundance is relative to the control of expression such as housekeeping genes. Therefore, the reliability of RT-qPCR depends essentially to the choice of these internal controls also called reference genes. That is the reason why a prior validation of reference genes is suggested for every set of cDNA samples used in a new RT-qPCR experiment. This study aimed to analyze the stability of eleven selected house-keeping genes in three Hevea brasiliensis tissues (leaf, bark and root) under15 days of moderate water deficit. Total RNA was isolated from 18 samples consisting of control and stressed-plants collected at day-0 (D0), day-5 (D5) and day-15 (D15).The quality of cDNA synthesized was examined by PCR using HbActin primer. The eleventh primers encoding Hevea housekeeping genes (HbActin, HbelF1Aa, HbUBC4, HbUBC2b, HbYLS8, HbRH2b, HbRH8, HbUBC2a, HbαTub, Hb40S and HbUBI) were validated using PCR amplification. The Crossing-point (Cp) values were measured using a second derivative method after RT-qPCR analysis revealing a significantly higher Cp mean values for 11 housekeeping genes at D5 compared to D0 and D15 sampling points. This study suggests that a simple coefficient of variation (CV) method can be used to rank Hevea reference genes based on its stable expression. Five housekeeping genes (HbRH2b, HbRH8, HbUBC4, HbαTUB and HbActin) can be used for RT-qPCR analysis in Hevea brasiliensis under moderate water deficit. The HbRH2b gene was the most stable among others.