Konstruksi pustaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037 yang diinfeksi patogen Corynespora cassiicola Construction of a cDNA library from leaf of AVROS 2037 rubber clone infected by Corynespora cassiicola pathogen

Abstract

Summary
Construction of cDNA library derived from
transcripts made under certain condition is an
important first step to understand disease
resistant mechanisms. To identify rubber genes
or transcripts involved in defense response
toward Corynespora cassiicola, cDNA library
was constructed using rubber clone AVROS
2037, one of resistant clone to this pathogen.
cDNA library was constructed based on the
strategy of leaves infection using conidia, with
the assumption that transcript expression related
to defense response would be induced by
pathogen infection. RNA was isolated from leaves
three days after inoculation with conidia of
C. cassiicola. Steps involved in the cDNA library
construction were RNA isolation, mRNA
purification, cDNA synthesis, vector modifcation,
cDNA insert ligation, plasmid transformation and
clone verifications. Each gram of leaf produced
approximately 300  g RNA, and 0.25% of them
was mRNA. The mRNA was used to synthesized
cDNA. Ligation of cDNA and modified vector
was facilitated by restriction enzyme SfiI. The
constructs were transformed into the E. coli
DH5 competent cells. A total of 8000 colonies
were produced. Random examination of 270
colonies showed that approximately 93% of these
colonies carried plasmid vector with DNA insert
size of 200 – 2000 bp, with average size of 500 –
800 bp. cDNA library construction of rubber
leaves from AVROS 2037 clone as well as some
necessary modification steps are presented in this
paper.

Ringkasan
Konstruksi pustaka cDNA yang me-
ngandung transkrip yang diekspresikan dalam
kondisi tertentu merupakan tahap awal yang
sangat penting dalam berbagai studi biologi.
Untuk mengidentifikasi gen karet atau transkrip
yang berperan dalam respons pertahanan tanaman
karet terhadap Corynespora cassiicola, pustaka
cDNA dibuat dengan menggunakan daun klon
AVROS 2037 yang merupakan salah satu klon
resisten terhadap patogen tersebut. Pustaka
cDNA dibuat berdasarkan strategi menginfeksi
daun dengan konidia C. cassiicola dengan
pertimbangan bahwa ekspresi transkrip yang

berperan dalam respons pertahanan akan
diinduksi oleh adanya infeksi patogen. Dengan
demikian pustaka cDNA yang dibuat diharapkan
mengandung gen atau bagian gen yang ber-
hubungan dengan respons pertahanan. RNA
diisolasi dari daun setelah daun diinokulasi
selama tiga hari dengan konidia C. cassiicola.
Beberapa tahapan telah dilakukan, dimulai
dengan isolasi RNA, pemurnian mRNA, sintesis
cDNA, modifikasi vektor kloning, ligasi fragmen
cDNA utas ganda dengan vektor kloning serta
transformasi hasil ligasi ke bakteri Escherichia
coli DH5 kompeten. Dari setiap gram jaringan
daun berhasil diisolasi RNA sekitar 300 g, dan
dari jumlah tersebut sekitar 0,25% mRNA dapat
diisolasi. mRNA yang diisolasi digunakan untuk
sintesis cDNA. cDNA dipotong dengan enzim
restriksi SfiI dan diligasi ke vektor plasmid yang
dimodifikasi dengan menyisipkan situs enzim
SfiI. cDNA-vektor rekombinan ditransformasi ke
dalam sel bakteri E. coli DH5 kompeten meng-
gunakan metode standar. Transformasi konstruk
ini menghasilkan 8.000 koloni. Pengujian PCR
terhadap 270 koloni yang dipilih secara acak
mengindikasikan bahwa sekitar 93% koloni
tersebut membawa cDNA sisipan dengan ukuran
fragmen cDNA yang menyisip berkisar antara
200 sampai 2000 bp. cDNA sisipan terbanyak
terdapat pada ukuran antara 500 – 800 bp. Dalam
tulisan ini dibahas tahap demi tahap proses yang
dilakukan untuk membuat pustaka cDNA asal
daun karet klon AVROS 2037 serta beberapa
modifikasi yang diperlukan.